东华大学史向阳/沈明武团队 ACS Nano：基于树状大分子的共递送体系用于MR成像引导的肿瘤化学动力学/免疫联合治疗

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近年来，免疫治疗逐渐兴起，成为与手术、放疗和化疗并重的新一代肿瘤疗法。然而，受到肿瘤微环境（TME）中多种免疫抑制因素的影响，单一模态的免疫疗法往往无法产生强有力的抗肿瘤免疫反应，治疗效果有限。因此，深入挖掘肿瘤的发生发展机制，针对TME的特点，发展更为高效的联合免疫治疗方法十分重要。纳米药物递送系统的快速发展为联合免疫治疗提供了诸多机遇。其中，锰基纳米材料受到广泛关注。含锰化合物，如二氧化锰（MnO₂）可以对TME高含量的谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢（H₂O₂）和弱酸性 pH作出响应，产生Mn²⁺实施基于类芬顿反应的化学动力学治疗，催生肿瘤细胞免疫原性死亡（ICD），实现TME调节和磁共振（MR）成像。同时，Mn²⁺也对抗肿瘤免疫中的cGAS-STING通路具有重要激活作用，具有免疫激活剂的功能。因此，设计合适的纳米药物递送系统集成Mn的多重功能，有望实现强效的抗肿瘤免疫治疗。

东华大学的史向阳教授/沈明武研究员团队长期致力于基于树状大分子的纳米递送体系构建及生物医学应用，团队近年来开发了多种基于聚酰胺-胺或含磷树状大分子的递送系统，实现了肿瘤免疫治疗与化疗、光热治疗、肿瘤自噬抑制或肿瘤血管破坏等疗法的强强联合（Adv. Mater. 2022, 34, 2206861；Adv. Mater. 2023, 35, 2208277；J. Control. Release 2023, 355, 171-183；Nano Today 2023, 51, 101936；Small 2023, 19, 2301914）。

近期，基于第五代聚酰胺-胺树状大分子，团队构建了一种表面修饰聚乙二醇和苯硼酸，内部包裹MnO₂纳米颗粒的树状大分子（MnO₂@G5-mPEG-PBA，简称MGPP），并以其为载体构建了天然酶葡萄糖氧化酶（GOx）和STING激动剂环二核苷酸cGAMP的共递送系统（图1a）。该体系有效集成了Mn的多重功能，在进行肿瘤局部给药后，能够在TME中释放出Mn²⁺，实施肿瘤的MR成像，并与天然酶和环二核苷酸的功能产生良好协同作用，通过化学动力学/饥饿/免疫治疗三重激活全身性抗肿瘤免疫反应（图1b）。

图1. （a）MGPP 的合成路线及负载GOx和（b）cGAMP用于联合治疗的示意图。

研究中合成的MGPP纳米载体具有粒径为2.8 nm 的MnO₂内核（图2a-b），XPS分析显示合成的MGPP中Mn的价态为正四价（图2c）。载体材料展现出高效的GSH消耗能力（图2d-e），在与GSH反应产生Mn²⁺后的r₁弛豫率高达8.37 mM^-1s^-1，能够用于T₁加权的MR成像，并促进与H₂O₂的类芬顿反应产生羟基自由基（图2f-g）。实验中发现MGPP在TME模拟条件下可快速释放Mn²⁺（图2h-i）。后续实验结果发现MGPP载体材料能够便捷地负载GOx与cGAMP，对于癌细胞实现增强的化学动力学杀伤，有效触发癌细胞ICD，促进树突状细胞的成熟。

图2. （a）MGPP的TEM图像和（b）尺寸分布直方图。（c）MGPP的Mn 2p 的XPS分析图。不同锰浓度的MGPP的在有无GSH与处理条件下的（d）T₁ MR成像伪彩照片和（e）弛豫性能。在不同浓度GSH 存在下，亚甲基蓝溶液与 MGPP混合30分钟后的（f）照片和（g）紫外吸收曲线（[NaHCO₃/CO₂] = 25 mM，[MB] = 10 μg/mL，[H₂O₂] = 10 mM，[Mn] = 0.25 mM）。（h）MnO₂与GSH、H₂O₂和H⁺的反应式。（i）在不同条件下MGPP的Mn²⁺释放曲线。

研究团队建立了小鼠双侧皮下CT26结直肠癌肿瘤模型，按图3a所示时间线进行了抗肿瘤实验评价。实验结果发现，21天的实验周期内各实验组小鼠体重缓慢增长，各组别之间无明显差异，表明材料注射后均不存在明显的系统毒性（图3b）。通过监测肿瘤体积变化，发现瘤内注射MGPP/GOx + cGAMP能显著抑制小鼠原发肿瘤的生长，肿瘤抑制率（TSR）高达 99.2%（图3c）。从各组荷瘤小鼠的个体原发肿瘤生长曲线（图3d）、远端肿瘤生长曲线（图3e）和治疗最后一天的照片（图3f）可以更为直观地看出，相比于其他实验组，经MGPP/GOx + cGAMP 治疗后，小鼠的原发和远端肿瘤几乎完全消退，小鼠的总体存活率大大提升，所有的小鼠存活时间均能达到120天。与此同时，团队使用单侧荷瘤小鼠模型，验证了共递送体系的体内MR成像效果。对荷瘤小鼠注射与抗肿瘤实验中相同剂量的MGPP/GOx + cGAMP后，能观测到肿瘤部位的MR信号明显增强（图3g），且注射30分钟后肿瘤部位信噪比即达到峰值（图3h），表明共递送体系在肿瘤部位能够快速释放Mn²⁺离子，实施MR成像监测。

图3.（a）小鼠双侧 CT26 肿瘤建立和抗肿瘤实验评价流程示意图。（b）肿瘤小鼠经不同材料处理后的 TSR、（c）体重变化、（d）原发肿瘤和（e）远端肿瘤体积变化。（e）中插图显示120 天后各组小鼠的存活数量。（f）各组荷瘤小鼠在治疗21天后的代表性照片，肿瘤照片中右边为原发肿瘤，左边为远端肿瘤。比例尺 = 1 厘米。荷瘤小鼠肿瘤局部注射MGPP/GOx + cGAMP后不同时间点的（g）T₁ MR成像伪彩图和（h）信噪比值。

取治疗后各组小鼠的原发肿瘤进行切片染色和Western Blot分析，发现MGPP/GOx + cGAMP组小鼠的肿瘤凋亡、坏死及免疫原性死亡产生最多（图4a-c）。同时由于Mn与cGAMP的协同作用，MGPP/GOx + cGAMP组小鼠肿瘤中STING通路相关的蛋白表达水平显著高于其他实验组（图4d-e），小鼠血清中的抗肿瘤相关细胞因子水平包括TNF-α、IL-6 和IFN-γ等也明显提升（图4f-h）。

图4. 各实验组小鼠原发肿瘤切片的代表性（a）TUNEL、（b）H&E 和（c）CRT 染色图片。比例尺 = 100 μm。（d）各实验组小鼠原发肿瘤中 STING、p-STING、TBK1、p-TBK1、IRF-3 和 p-IRF3 表达水平的 Western Blot分析及（e）蛋白表达定量结果图。各实验组小鼠血清中（f）TNF-α、（g）IL-6 和（h）IFN-γ的ELISA检测结果。

为验证小鼠系统性抗肿瘤免疫反应的激活，团队进一步对各实验组小鼠脾脏T细胞群进行了流式分析，并对小鼠肿瘤和瘤周淋巴结组织进行了免疫荧光染色。实验结果表明，相比于其他实验组，经过共递送体系局部治疗后的小鼠脾脏中分布有最多的CD8⁺ T细胞和最少的免疫抑制型Treg细胞，原发肿瘤组织中具有显著多的T细胞浸润和抗肿瘤M1表型巨噬细胞分布，淋巴结中也观测到更多的成熟树突细胞，验证了系统性抗肿瘤免疫反应的产生。同时，通过体内安全性评价，团队发现该体系介导的肿瘤局部治疗安全性好，不会过多地蓄积于主要脏器及产生不良影响，有望发展成为一种安全高效的免疫治疗策略。

以上研究工作以“Manganese Dioxide-Entrapping Dendrimers Co-Deliver Protein and Nucleotide for Magnetic Resonance Imaging-Guided Chemodynamic/Starvation/Immune Therapy of Tumors”为题，发表在美国化学会期刊ACS Nano上。东华大学生物与医学工程学院的史向阳教授和沈明武研究员为共同通讯作者，博士研究生高悦为第一作者。该工作得到上海市第一人民医院王悍教授团队的大力支持，并受到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委、上海市科委等项目及中央高校基本科研业务费专项资金的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1021/acsnano.3c08174

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